概述

荧光是指一种光致发光的冷发光现象。

光致发光

物体依赖外界光源进行照射，从而获得能量，产生激发导致发光的现象。它大致经过吸收、能量传递及光发射三个主要阶段，光的吸收及发射都发生于能级之间的跃迁，都经过激发态。

原理

1.光谱类型

荧光光谱是物质分子吸收紫外光后产生的

分子发射光谱。

2.跃迁类型

分子中原子的电子能级跃迁伴随

振动能级的跃迁。

3.分子的激发与失活

(1)分子的激发

①基态→激发态(S

1、S

2、激发态振动能级):吸收特定频率的辐射，跃迁一次到位。

②激发态→基态:多种途径和方式，速度最快、激发态寿命最短的占优势。

③单重态:一个分子中所有电子自旋都配对的电子状态。

④三重态:有两个电子的自旋不配对而平行的状态。激发三重态能量较激发单重态低。

a.大多数有机物分子含有偶数电子，这些电子成对且自旋方向相反地存在于各个原子或分子轨道上。所以大多数分子在基态时处于单重态。

b.分子吸收光子并从基态跃迁到第一激发态或更高的激发态中的某个振动能级，分子仍处于单重态。持续一段时间后

激发态电子的自旋可能倒转，生成三重态.

c.单重态能级间的跃迁符合光谱规律，跃迁概率大。分子 通过吸收辐射而直接被激发到三重态的跃迁是禁阻的，概率很小。

4.跃迁的方式与激发态分子失活

(1)无辐射跃迁

①振动弛豫:

由于分子间的碰撞，激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级转至较低振动能级的过程，其效率较高。激发态分子常常首先发生振动驰豫。

②内转换:

相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级回到低能级的分子内过程。

③系间窜越：

激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的过程。含有重原子的分子中(如I、Br等)，系间窜跃最常见。

④外转换：

激发态分子与溶剂或其他溶质相互作用和能量转换而使荧光(或磷光)减弱甚至消失的过程。

荧光强度的减弱或消失，称为荧光熄灭或猝灭。

(2)辐射跃迁

磷光:

①若第一激发单重态的分子通过系间窜跃到达第一激发三

重态，再通过振动驰豫转至该激发的最低振动能级，然后以辐射的形式回到基态，发出的光线称为磷光。

②由于激发三重态能量较激发单重态低，所以磷光的波长

比荧光的波长稍长。

③磷光仅在很低的温度或黏性介质中才能观测到。因此磷光很少应用于分析。

荧光:

①受光激发的分子经振动驰豫、内转换、振动驰豫到达第一电子激发单重态的最低振动能级，以辐射的形式失活回到基态，发出荧光。

②由于无辐射使分子吸收的能量有部分损失，因此荧光的能量比吸收的能量小，即荧光波长一般比激发光波长长。

荧光产生的过程

5.激发谱与发射谱

任何荧光化合物都具有激发光谱(吸收光谱)和发射光谱(荧光或磷光光谱)两种特征光谱。

(1)激发谱:

荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率。

(2)发射谱:

某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。

(3)激发光谱和发射光谱具有三个特点:

①斯托克斯位移，波长:荧光>激发光;

②荧光光谱和激发光谱大致成镜像对称;

③荧光发射光谱的形状与激发光波长无关。

6.荧光寿命(Tf)

荧光寿命(τ

f):

除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的一半所需的时间称为荧光寿命(10

-8~10

-10s)。荧光物质受到一个极短时间的脉冲光激发后，荧光强度从激发态到基态的变化，可用指数衰减定律表示:

分子荧光光谱法的特点

1.灵敏度高

荧光分析是由试样溶液所发生的荧光的强度来测定试样溶液中荧光物质的含量。荧光分析的灵敏度不仅与溶液的浓度有关，而且与紫外光照射强度及荧光分光光度计的灵敏度有关.因此荧光分析的灵敏度高于一般的分光光度法，最低检出限比分光光度法低一个数量级以上，适合于痕量物质的检测。

2.选择性好

凡是会发生荧光的物质首先必须会吸收一定频率的光，但会吸收光的物质却不一定会产生荧光。对于某一给定波长的激发光，产生荧光的物质发出的荧光波长也不相同，只要控制荧光分光光度计中激发光和荧光单色器的波长便可得到选择性良好的方法。

3.能够引起荧光的化学物质较少，应用范围小

大多数物质本身不会产生荧光，一些物质在加入某种试剂后能够产生荧光。

影响荧光强度的因素

(1)内部因素

①自猝灭--发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射转移。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。

②自吸收--荧光化合物的发射光谱的波长与其吸收光谱的波长重叠，溶液内部激发态分子所发射的荧光在通过外部溶液时被同类分子吸收，从而使荧光被减弱。

③荧光强度F与光源的辐射强度I0有关，因此增大光源辐射功率I

0可提高荧光测定的灵敏度。紫外-可见分光光度法无法通过改变入射光强度来提高灵敏度。

(2) 环境因素

①温度

温度对荧光的影响很大。

温度降低会减少碰撞和非辐射失活的概率因此会增加荧光强度。例如:荧光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10℃，荧光产率增加3%，当温度降低至-80℃时，荧光产率为100%。

②pH值

含有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与 pH有关。pH的变化影响了荧光基团的电荷状态，从而使其荧光发生变化。

③溶剂

溶剂极性增加，有时会使荧光强度增加，荧光波长红移。

若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧光物质电离状态改变，会使荧光强度、荧光波长改变。

含重原子的溶剂(碘乙烷、四溴化碳)使荧光减弱，磷光增强。

④溶解氧

往往使荧光强度降低。

荧光法的应用

1.常规荧光光谱测试:

(1)在紫外光区内，固定激发光波长(可以任意选择几个)对荧光物质进行荧光发射光谱的扫描，从而确定产生最大的荧光强度时的荧光波长λ

2

(2)固定荧光波长λ2，对荧光物质进行激发光谱的扫描，确定最佳的激发光波长λ1。

2.定量荧光光谱测试:

标准曲线法:

配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度在标准曲线上求出浓度。

比较法:

在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，再进行比较。

3.无机物的荧光分析

①无机物能够直接产生荧光并用于测定的很少。可通过与荧光试剂作。

②用生成荧光配合物、或通过催化或猝灭荧光反应进行荧光分析。

③非过渡金属离子的荧光配合物较多。可用于荧光分析的元素已近70种。

④荧光试剂是具有两个或以上与M

n+形成螯合物的电子给予体官能团的芳香结构。

4.无机化合物的分析

①铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法:

②氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定;

③铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定;

④铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定;

⑤铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定。

5.有机物的荧光分析

①荧光法在有机化合物中应用较广。芳香化合物多能发生荧光。脂肪族化合物往往与荧光试剂作用后才可产生荧光。

6.荧光光谱在生物与医学上的应用

7.核壳荧光纳米颗粒与活细胞的生物亲和性研究

①单个细菌的检测。

②疾病早期诊断。

8.荧光光谱在食品中的应用

食品中含有很多具有荧光特性的物质如芳香族氨基酸、蛋白质中色氨酸残基、多酚类物质、黄酮类物质叶绿素、维生素、核黄素以及美拉德产物等，一些食品添加剂、农药和工业污染物也具有内源性荧光，这些物质的荧光图谱为食品定性定量技术提供基本信息。

分子荧光光谱新技术

1.前表面荧光技术。

2.同步荧光光谱技术。

3.三维荧光光谱技术。